克隆、轉(zhuǎn)化相關(guān)問題
為使亞克隆實(shí)驗(yàn)成功，并能在未獲得目的克隆時(shí)，查明實(shí)驗(yàn)失敗的原因，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括相應(yīng)的對照。其中包括：
感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率
抗菌素是否有效
連接的效率
未連接質(zhì)粒的背景
磷酸酶處理的效果
轉(zhuǎn)化效率1×106 cfu/mgDNA可滿足普通的亞克隆實(shí)驗(yàn)；1×107 cfu/mgDNA用于作更復(fù)雜的亞克隆，有限量的DNA的轉(zhuǎn)化，T-克隆實(shí)驗(yàn)；構(gòu)建文庫和突變要求用的轉(zhuǎn)化的效率為>1×108 cfu/mgDNA。
4、 使用pGEM載體克隆大片段時(shí)（＞7-8Kb），轉(zhuǎn)化時(shí)菌株在30℃而不是37℃生長，更有利于細(xì)胞的復(fù)蘇。
為檢測連接反應(yīng)的效果，線化（單限制性酶切，非磷酸酶處理）質(zhì)粒需同實(shí)驗(yàn)樣品平行連接。取一部分連接反應(yīng)液用于轉(zhuǎn)化，隨后涂布到選擇培養(yǎng)基上。平板上所生長的菌落數(shù)，可同相同量、未連接的線化質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化相同數(shù)目的細(xì)菌后，涂布在選擇培養(yǎng)基上所生長的菌落數(shù)比較。如果連接成功，自連接質(zhì)粒在平板上的菌落數(shù)，會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未連接的線化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌所得的菌落數(shù)。如果線化成功，未連接的線化質(zhì)粒（未連接的質(zhì)粒背景）所得的菌落數(shù)應(yīng)很低。如連接效率高，則自連質(zhì)粒所得的菌落數(shù)應(yīng)同用完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌所得的菌落數(shù)相近。 另一種非定量的方法是將等量的未連接質(zhì)粒和連接質(zhì)粒在瓊脂上電泳，連接后的樣品的遷移率會降低。
1．確認(rèn)Insert DNA片段的3＇末端是否帶有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平滑末端，不能直接進(jìn)行TA克隆。
2．純化PCR產(chǎn)物。最好使用切膠回收的PCR片段，以除去PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。進(jìn)行切膠回收時(shí)可以使用莊盟是生物的小量瓊脂糖凝膠回收試劑盒（ZP202）。
3．請使用轉(zhuǎn)化效率大于108cfu/μg pUC19 DNA的感受態(tài)細(xì)胞。
4．DNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長短都會影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）偏低，此時(shí)可以延長連接反應(yīng)時(shí)間，或采用電轉(zhuǎn)化方法。
5．進(jìn)行切膠回收純化DNA片段時(shí)，不要使DNA片段在紫外線下暴露時(shí)間過長。
6．建議使用新配制的平板培養(yǎng)基。
陽性克隆鑒定方法有哪些?
1．藍(lán)白斑篩選。
藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，一般情況下，β-半乳糖苷酶的表達(dá)將受到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)將顯示白色菌落。但有時(shí)比較短的DNA片段插入載體時(shí)，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的讀碼框相吻合，克隆體也會顯示藍(lán)色菌落。有報(bào)道稱，2 kbp的DNA片段插入到載體中后，重組克隆體仍顯示了藍(lán)色。所以，當(dāng)我們沒有得到白色菌落時(shí)，可以試著檢測藍(lán)色菌落。
2．菌落PCR方法。
以變性后的菌液為模板，使用載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。
使用滅菌后的牙簽挑取白色菌落，在預(yù)備好的ddH2O（10μl）中蘸洗，99℃，10 min變性，冰上急冷，加入配制好的PCR混合液（引物，dNTP，Buffer， Taq等）。
94℃ 1 min
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec 30 Cycles
72℃ 1 kbp/min
說明： a．所用引物通常為載體通用引物。
以提純后的質(zhì)粒DNA為模板，使用PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。
94℃ 1 min
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec 30 Cycles
72℃ 1 kbp/min
說明：擴(kuò)增產(chǎn)物的大小就是PCR產(chǎn)物的大小。
利用載體多克隆位點(diǎn)上限制酶或者PCR引物導(dǎo)入酶切位點(diǎn)的限制酶，對提純后的質(zhì)粒DNA進(jìn) 行雙酶切鑒定。 說明：雙酶切后，電泳顯示兩條帶，分別為載體大小和PCR產(chǎn)物的大小。
1 問題：做轉(zhuǎn)化時(shí)，用藍(lán)白斑篩選，以獲得陽性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用藍(lán)白斑篩選，有什么區(qū)別嗎？藍(lán)白斑篩選有什么作用嗎？
對于這一問題，我想，抗性篩選是防止雜菌生長。理論上說，當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖。藍(lán)白篩選是驗(yàn)證是否有插入片斷。兩者結(jié)合起來，更有利于篩選到我們的目的菌。
2 問題：如果加了AMP、IPTG和X-Gal，長出來的白斑一定都是含有插入片段的嗎？有沒有可能是載體自連的？
答：可以說，世界上沒有絕對的事情，即使加了AMP、IPTG和X-Gal，長出來的白斑也不一定都是含有插入片段的陽性克隆，具體原因可能有：
1）有可能是載體自連的假陽性；
2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。
3）有時(shí)即使插入片段也會出現(xiàn)籃斑。只要編碼框沒被破壞。
3 問題：如何篩選重組菌落?
答：可使用藍(lán)/白斑篩選法，在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上，重組菌株為白色，未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株為藍(lán)色。
4 問題：藍(lán)白斑篩選如何篩選合適的宿主菌株?
答：如進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區(qū)應(yīng)在染色體或附加體上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于藍(lán)/白斑篩選。
5 問題：在藍(lán)白斑篩選的過程中沒有藍(lán)斑是什么原因?qū)е碌模恳驗(yàn)橥ㄟ^PCR檢測插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并沒有插入片段。
答：原因很多，
1）可能是你用的培養(yǎng)基含有乳糖或葡萄糖，因?yàn)榘肴樘歉拭笗纸馊樘牵瑢?dǎo)致不能與X-Gal反應(yīng)，葡萄糖不會誘導(dǎo)融合基因的表達(dá)。
2）作時(shí)AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。
3）很多因素會造成PCR失敗。
6 問題：我最近轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，通過藍(lán)白斑篩選，挑出白色菌落做PCR，可是在電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)在有目的帶的同時(shí)還有比目的帶小的雜帶，不知為什么？我反復(fù)篩了幾次，都是這樣，可不可以搖菌提質(zhì)粒？我應(yīng)該下一步怎么做？
答：針對這樣的情況，我覺得，你首先做酶切鑒定，看看你的目的片段是否真正插入。其次，你應(yīng)該檢測PCR過程有沒有問題。
7 問題：我用Amp-IPTG-X-gal LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選重組子，為何篩出的全是白斑，沒一個(gè)藍(lán)斑，挑幾個(gè)白斑搖菌擴(kuò)增后PCR檢測也全是陽性克隆，不會全都重組成功了吧？什么原因呢？
答：這樣的情況是完全有可能的，只要載體處理的好，應(yīng)該說是有這種可能。
藍(lán)白斑篩選是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。
IPTG 與X-Gal介紹
IPTG即Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，也稱Isopropyl β-D-thiogalactoside，中文名為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。分子式為C9H18O5S ，分子量為238.30，CAS Number 367-93-1，Ultra Pure，dioxane free，常用于藍(lán)白斑篩選，如果在平板培養(yǎng)基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互補(bǔ)性，可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組體。此外，它還可以作為具有lac或tac等啟動子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物使用。
IPTG 與X-Gal配置
IPTG配制成24 mg/ml（100 mM）的水溶液，并進(jìn)行過濾除菌后保存。
X-gal用二基甲酰胺DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。
使用方法：
在100 ml的瓊脂培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)基溫度為55℃左右時(shí)，加入100 μl的24 mg/ml（100 mM）IPTG、200 μl的X-Gal（20 mg/ml）和100 μl的Amp（100 mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。
